摘要： 目的:CROC - 1 是人体细胞内新近发现的一个编码泛素缀合酶样蛋白(ubiquitin2conjugating enzyme like protein , Ubc2likeprotein) 基因。已知CROC - 1 基因的酵母同源基因MMS2 参与酵母细胞内RAD6 途径中的无误性复制后修复通路。酵母mms2 无功效突变株表现出REV3 依赖性增变表型(mutator phenotype) 。人CROC - 1 基因是否与酵母MMS2 基因一样,参与人体细胞内的无误性复制后修复、维持基因组的稳定性,至今未见有文献报道。为此,我们运用反义技术建立CROC - 1 基因表达被阻断的FL - CROC - 1 - 细胞系,通过研究该细胞系的一系列生物学特性来分析CROC - 1 基因与DNA 修复、基因组稳定性维持、致癌物诱发的遗传不稳定性及肿瘤发生之间的关系。方法:11CROC - 1 反义RNA 表达质粒的构建:用ACCⅠ酶从pBluescript2Croc21B 上切出840bp 长包含Croc - 1B 蛋白整个开放阅读框的cDNA 片断,用Klenow 片断将其两端填平,再用T4 DNA Ligase 在目的片断的两端连上Sal ⅠLinker ,而后经Sal Ⅰ酶切使其两端皆为Sal Ⅰ粘性末端,再将目的片断用T4 DNA ligase 连到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo2amp2的多克隆位点的Sal Ⅰ切点(经过CIP 处理脱去磷酸基团)上,最后用Nhe Ⅰ酶切(在插入片断上的上游载体的多克隆位点上及插入片断的内部第622 位碱基处分别有一Nhe Ⅰ切点)并分析酶切图谱,从而筛选出反向插入的表达CROC - 1 反义RNA 重组子;21 细胞转染及筛选:用改良的磷酸钙法将构建的CROC - 1 反义RNA 表达重组质粒pMAMneo2antiCROC21 20230μg 转染培养的人羊膜FL 细胞,经G418 筛选培养(400μg/ml) ,3 周后可见细胞克隆,然后换成含G418 的维持培养基(200μg/ ml) 继续扩大培养成FL - CROC - 1 - 细胞系,同时转染空载体pMAMneo2amp2建立FL - MAMneo 细胞系作为载体对照;31 细胞生长曲线测定:将FL 、FL - MAMneo 及FL - CROC -1 - 细胞分别以3 (104cells/ ml) 种于24 孔培养板,每种细胞6 组,每组4 个复孔,经地塞米松(工作浓度为10 - 5mol ,用于诱导重组质粒pMAMneo - antiCROC - 1 表达CROC - 1 反义RNA) 诱导于37 ℃、5 %CO2 下培养24 小时,第二天开始每天计数,计6 天。结果:构建好的重组质粒经Nhe Ⅰ酶切,酶切产物琼脂糖电泳后其一个重组质粒出现228bp 及9kb 二条带,说明该重组质粒是反向插入的表达CROC - 1 反义RNA 的重组质粒pMAMneo2antiCROC - 1 ;pMAMneo2antiCROC - 1、pMAMneo2amp2分别转染FL 细胞,经筛选培养,3 周后分别得到10 多个细胞克隆,换以维持培养基扩大培养成FL2CROC21 、FLMAMneo 细胞系并冻存备用;细胞计数发现,头3 天内FL2CROC212细胞的生长速度与对照FL 及FL2MAMneo 细胞的生长速度无明显差异,从第4 天开始,FL2CROC212细胞的生长速度较对照FL 及FL2MAMneo 细胞的明显要慢,统计分析结果差异明显( P < 0. 05) 。结论:11 本研究成功地建立了CROC - 1 基因表达被阻断的FL - CROC - 1 细胞系;21 本研究结果说明CROC - 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞的生长过程中起正调控作用。