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当期目录

1999年 第11卷 第6期 刊出日期:1999-11-30
致突变研究
加拿大洋参含片的急性毒性和致突变性试验
马晓彤 王庭欣 赵 文 蒋东升 秦淑贞 边庆荣
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  285-286.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.001
摘要 ( 2989 )   PDF (68KB) ( 2522 )  
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目的:加拿大洋参含片是由西洋参、蔗糖等原料加工而成的,具有抗疲劳作用。为确保食用安全,我们对其进行了急性和致突变性试验。方法: 按《食品安全性毒理学评价程序和检验方法》进行。结果: 大小鼠急性经口毒性LD50 均大于21500mg/ kg ,属无毒物;Ames 试验剂量为0. 2mg/ 皿、018mg/ 皿、112mg/ 皿、116mg/ 皿,同时设空白对照(蒸馏水) 、阳性对照(2 - AF ,2 ,4 ,7 - TNFone) ,结果加拿大洋参含片各剂量组在加S9 和不加S9 条件下的回变菌落数均未超过空白对照回变菌落的2 倍,阳性对照回变菌落数达阳性标准,表明本研究未见加拿大洋参含片引起组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的回复突变;小鼠骨髓细胞微核试验剂量为10. 0g/ kg、510g/ kg、215g/ kg ,同时设阴性对照(蒸馏水) ,阳性对照(CP 40mg/ kg) 。试验组微核率分别为1. 9 ‰、1. 9 ‰、2. 1 ‰。阴性对照组微核率为1. 8 ‰,阳性对照组微核率为32. 41. 9 ‰;小鼠精子畸形试验剂量10. 0g/ kg、510g/ kg、215g/ kg ,精子畸形率分别为20. 4 ‰、2212 ‰、1816 ‰,阴性对照组(蒸馏水) 精子畸形率为23. 6 ‰。阳性对照组(CP 40mg/ kg) 精子畸形率为102. 0 ‰;经统计学处理微核率、精子畸形率试验组与阴性对照组比较,差异无显著性。结论:本研究发现加拿大洋参含片属无毒物,Ames 试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验均得到阴性结果,说明加拿大洋参含片在该组筛检试验中无诱变性,将为其作为保健食品的开发利用提供一个依据。
用诱变实验初步鉴定防秃生发液的诱变性
徐品良  富景辉  刘会山  陈 岩
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  285-285.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.002
摘要 ( 1959 )   PDF (62KB) ( 2792 )  
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桃花牌防秃生发液是全中药制剂。对头发再生有很好的临床疗效,为检测防秃生发液是否对人体有潜在遗传毒性,我们根据安全评价程序,对其进行急性毒性及致突变试验。结果如下: ①急性毒性:通过小鼠Hom 氏法测得急性经口LD50值>5000 mg/ kg 体重。按急性毒性分级标准属实际无毒。②Ames 试验:实验菌株TA97 、TA98 、TA100、TA102 由Ames 实验室提供。生发液用灭菌蒸馏水稀释成5μg/ 皿、50μg/ 皿、500μg/ 皿、2500μg/ 皿、5000μg/ 皿五种浓度。培养基制备,菌株基因型鉴定S9 的制备,均按国内统一标准方法操作。采用平板掺入法。在加S9 和不加S9 混合液条件下重复3 次实验表明,各剂量组的自然回变菌落数均未超过对照组的自然回变菌落数的两倍。而阳性组回变菌落数均超过自发回变菌落数的两倍以上。Ames 实验结果判定阴性,在本剂量范围内生发液对Ames 实验菌株无致突变性。③小鼠骨髓微核试验:用昆明种雄性小鼠30 只,体重22~25g ,随机分为6 组。染毒剂量5000mg/ kg、2500mg/ kg、1200mg/ kg、800mg/ kg 体重。阳性对照组:环磷酰胺40mg/ kg 体重。环磷酰胺腹腔注射,其余经口灌胃染毒,阴性对照组给等容积的蒸馏水,灌胃染毒后24h ,处死实验动物,制作骨髓片。每只小鼠计数1000 个PCE ,观察微核出现率,统计分析,生发液的各剂量组PCE 微核率没有明显增加,和阴性对照组比较无显著性差异( P > 0. 05) ;和阳性环磷酰胺组比较有非常显著差异( P < 0. 01) 。微核试验结果阴性。④小鼠精子畸形试验:实验动物用NIH 种雄性小鼠60 只,体重28 - 32g。随机分成6 组。每组10 只。设四个剂量组,及阴性、阳性对照组。染毒剂量5000mg/ kg、2500mg/ kg、1200mg/ kg、800mg/ kg 体重。阳性对照组50mg/ kg 体重环磷酰胺,腹腔注射。每天灌胃染毒连续6 天,在染毒后30 天脱颈椎处死实验动物,取两侧附睾制片。用2 %伊红染色,在高倍镜下观察精子形态,每只小鼠检测完整精子1000 个,计算精子畸形率,染毒剂量组与阴性对照组比较无显著性差异( P > 0. 05) ,与环磷酰胺组比较差异显著, ( < 0. 01) 。经上述四项实验表明,防秃生发液属实际无毒,诱变性阴性,未见有致突变作用。
梦泰宁( 褪黑素) 毒性研究
王庭欣 马晓彤 蒋东升 赵 文 秦淑贞 张俊刚
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  286-286.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.003
摘要 ( 3031 )   PDF (61KB) ( 2686 )  
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褪黑素是以松果体为主要成分的保健食品,具有改善小鼠睡眠的作用。由于国内市场上销售的褪黑素均为化学合成品,合成路线不同,其毒性有可能有差别。为此我们对石家庄开发区四联生物工程有限公司生产的褪黑素进行了毒性研究。按《食品安全性毒理学评价程序》的方法对褪黑素的急性毒性、致突变性及喂养试验进行了鉴定,结果表明大小鼠LD50 均大于10g/ kg. bw;小鼠骨髓细胞微核试验对照组( 蒸馏水) 与三个剂量组( 1. 25g/ kg. bw、2. 5g/ kg. bw、5. 0g/ kg. bw) 微核率分别为2.3 ‰、1. 5 ‰、1. 4 ‰、0. 9 ‰;小鼠精子畸形试验对照组( 蒸馏水) 与三个剂量组( 1. 25g/ kg. bw、2. 5g/ kg. bw、5. 0g/ kg. bw) 微核率分别为15. 6 ‰、13. 2 ‰、19. 4 ‰、16. 6 ‰;Ames 试验 采用平板掺入法,每个剂量做三个平皿并重复一次,褪黑素剂量为1.0mg/ 皿、215mg/ 皿、510mg/ 皿,同时设空白对照及阳性对照( 2 - F,2 ,4 ,7 - TNFone) ,结果褪黑素各不同剂量组在加S9 和不加S9 条件下的回变菌落数均未超过空白对照回变菌落的2 倍。阳性对照回变菌落数达阳性标准。喂养试验褪黑素剂量为5. 0g/ kg、215g/ kg、1125g/ kg 大鼠经30 天喂养生长发育良好,血液及生化指标均在正常范围内,各试验组与对照组比较无显著性差异,病理学检查结果心、肝、脾、肺、肾、胃、肠均基本正常。由此可见,褪黑素大小鼠LD50 > 10mg/ kg 属实际无毒物,致突变试验及30 天喂养试验均为阴性。
短期接触钒对人体细胞免疫遗传和增殖的影响
张家华  王宇文
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  286-286.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.004
摘要 ( 1783 )   PDF (61KB) ( 2689 )  
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目的:探讨短期接触钒及其化合物对作业工人细胞免疫、遗传和增殖的影响。方法:用细胞学组合检测法测定14 例五氧化二钒和三氧化二钒作业1~2. 5 年的工人的外周血淋巴细胞转化率(L TR) 、姊妹染色单体互换(SCE) 、微核率(MNR) 、有丝分裂指数(MI) 、细胞周期比率(CCR) 和增殖率指数(PRI) 。结果:L TR 作业组(73193 %) 与对照组(74. 43 %) 比较无显著性差异( P > 0. 05) ,作业工人男性(73. 84 %) 与女性(74. 00 %) 比较亦无显著性差异( P > 0. 05) ;SCE 作业组(5. 09/ 细胞) 与对照组(4. 44/ 细胞) 比较无显著性差异( P > 0. 05) ,男作业工人(5. 24/ 细胞) 与女作业工人(4. 82/ 细胞) 比较无显著性差异( P > 0.05) ;MNR 作业组(1. 14 ‰) 与对照组(1. 57 ‰) 比较无显著性差异( P > 0. 05) ,男作业工人(1. 22 ‰) 与女作业工人(1. 00 ‰) 比较无显著性差异( P > 0. 05) ;MI 作业组(9. 31 %) 比对照组(6. 95 %) 显著增高( P < 0. 005) ,女作业工人(11. 24 %) 与男作业工人(8. 23 %) 比较有高度显著性差异( P < 0. 005) ;CCR(M1 、M2 、M3) 和PRI :作业组分别为8. 89 %、18132 %、72179 %和2. 64 ,对照组分别为11. 32 %、26. 89 %、61. 79 %和2110 ,男作业工人分别为8. 78 %、19172 %、71150 %和2162 ,女作业工人分别为9. 10 %、15180 %、75110 %和2166 ,M3 及PRI 作业组显著高于对照组( P < 0. 005) ,女作业工人显著高于男作业工人( P < 0.05) 。结论:短期接触钒及其化合物对作业工人细胞免疫和细胞遗传学指标无明显影响,细胞有丝分裂指数、细胞周期比率和细胞增殖率指数显著进高,女性明显高于男性,值得进一步深入研究。
哺乳类细胞参与MNNG诱导的非定标性突变发生基因的分离和功能研究
胡文蔚 余应年 陈星若 宋 韬 谢海洋
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  287-287.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.005
摘要 ( 3049 )   PDF (68KB) ( 2849 )  
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目的:遗传不稳定是存在于人类遗传性疾病及肿瘤中的一种重要现象,也可由环境致癌性理化因子诱发,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验室已证实了烷化剂N - 甲基- N’- 硝基- N - 亚硝基胍(MNNG) 可以诱发出vero 细胞的遗传不稳定状态,表现为延迟发生的非损伤部位DNA 突变率增加(非定标突变) ,且突变谱明显不同于由MNNG直接攻击引起的定标性突变。转录抑制剂放线菌素D 可抑制这种突变的形成,提示它的发生依存于基因表达的改变。本研究目的是分离筛选参与以非定标性突变为特征的遗传不稳定发生的相关基因。方法:利用反义核酸技术,对本实验室用差异显示方法分离得到的EST 片段进行功能分析。首先改建了两个真核表达载体的抗性,利用抗性选择使之进入细胞后不会干乱利用穿梭质粒Z189 进行非定标性突变率检测的实验系统。利用此载体构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞,以获得反义RNA 阻断其相应基因的表达,再检测非定标性突变率的变化。结果:筛选得到两个EST 片段(片段9 ,片段10) ,它们相关基因的表达被阻断后,非定标突变率均发生了显著的改变。9 号片段相关基因的表达阻断后,非定标性突变率显著增高,vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp2细胞组及含正反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp29 ,自发突变率均较接近,分别为1. 6 ×10 - 4 ;4. 9 ×10 - 4 ;4. 7 ×10 - 4及4. 0 ×10 - 4 ,而MNNG处理后突变率均显著增高,分别为23. 6 ×10 - 4 ;36. 1 ×10 - 4 ;25. 0 ×10 - 4及67. 0 ×10 - 4 ,与自发突变率相比P < 0. 01 ,而其中vero2pM2amp29 - 细胞系在MNNG处理后pZ189 复制的突变率较其它各组的非定标性突变率进一步增高, P < 0. 05 ,在含反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp210 - 中,10 号片段的相关基因表达阻断后,非定标性突变率下降至自发突变水平。vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp - 细胞组及vero2pM2amp210 - 细胞组,自发突变率较接近,分别为17. 2 ×10 - 4 ;4. 6 ×10 - 4及5. 2 ×10 - 4 ,在MNNG处理后,突变率分别为17. 2 ×10 - 4 ;16. 1 ×10 - 4及2. 5 ×10 - 4 ,vero2pM2amp - 10 细胞组的非定标突变率与其它组比较P < 0. 01。结论:反义核酸技术筛选到两个分离片段的相关基因与哺乳类细胞非定标性突变发生有关,其中9 号片段的相关基因可能参与维持细胞遗传稳定性,抑制非定标性突变的发生,而10 号片段的相关基因则可参与引起烷化剂处理后细胞非定标性突变的产生。
MNNG诱导的哺乳类细胞信号转导通路的改变
鲁 靖 余应年 谢海洋
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  287-287.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.006
摘要 ( 2630 )   PDF (61KB) ( 2706 )  
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目的:本实验室曾用烷化剂N - 甲基- N’- 硝基- N - 亚硝基胍(N2methyl2N’2nitro2N2nitrosoguanidine ,MNNG) 在非洲绿猴肾vero 细胞上诱导出非定标性突变。进一步的研究提示细胞信号转导通路在非定标性突变的发生中扮演了重要角色。所以本实验的目的是研究与非定标性突变发生有关的细胞信号转导通路的改变。方法:本研究中,vero 细胞在0. 2μmol·L - 1MNNG处理2. 5h 后在不同的时间点制备全细胞抽提液,然后利用一种偶联抗Anti2Phosphotyrosine2Peroxidase) 进行Western 印迹分析来观察细胞蛋白质酪氨酸磷酸化的变化。为了评估MNNG处理vero 细胞引起的胞内JNK/ SAPK通路激活情况,我们用Western 印迹法和固相激酶活性测定法分别检测JNK1 的磷酸化程度和JNKs 的激酶活性。在这部分实验中,vero细胞在MNNG或1mg·L - 1放线菌素酮(CHM) 处理后在不同的时间点制备全细胞抽提液,Western 印迹法用抗JNK1 兔多克隆IgG和羊抗兔IgG- HRP 分别作为一抗和二抗。在固相激酶活性测定实验中,细胞抽提液在[γ232 PATP 存在下与GST2cJ un (79)2agarose 混合孵育,标记的磷酸化GST2c2J un 经SDS2PAGE 分离后进行放射自显影。结果:在磷酸化酪氨酸Western印迹分析中发现MNNG处理vero 细胞后再经0h 和12h ,细胞内45kDa 蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强。在MNNG处理vero细胞后再经6h ,有62kDa 蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强。1mg·L - 1CHM 处理vero 细胞12h 也可引起胞内45kDa 蛋白质酪氨酸磷酸化程度增强。在JNK1 磷酸化程度和JNKs 激酶活性测定中发现0. 2μmol·L - 1MNNG处理vero 细胞2. 5h 和1mg·L - 1CHM 处理vero 细胞1h 都可引起细胞抽提液中磷酸化JNK1 的比例增高,同时,通过测定JNKs 的底物c2J un 的磷酸化水平,发现这两种处理也都可使JNKs 的激酶活性大大增强(分别为对照的6. 7 倍和3. 0 倍) 。结论:本研究发现0. 2μmol·L - 1MNNG处理vero 细胞可引起胞内45kDa 的62kDa 蛋白质酪氨酸磷酸化改变,提示MNNG可诱导哺乳类细胞内应激信号转导通路激活。另外,0. 2μmol·L - 1MNNG处理vero 细胞2. 5h 和1mg·L - 1CHM 处理vero 细胞1h 都可引起全细胞抽提液中磷酸化JNK1 的比例增高和JNKs 的激酶活性成倍增强。证明用于诱导vero 细胞产生非定标性突变的实验条件可以引起vero 细胞内信号转导通路发生改变,并且至少可以激活vero 细胞内JNK/ SAPK通路。
FL-FEN-1-细胞的建立
石斌山 余应年
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  288-289.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.007
摘要 ( 1958 )   PDF (73KB) ( 2547 )  
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目的:FEN - 1 是一种结构特异性核酸酶,它识别特定的核酸分叉结构,并切除含有游离5’末端的单链核酸。FEN - 1有对DNA 复制和修复都必需的双重功能。目前有关FEN - 1 在高等动物和人类中的系统研究尚无报道。本实验采用反义核酸技术,得到FEN - 1 基因表达被阻断的哺乳动物细胞FL - FEN - 1 - ,为进一步在哺乳动物细胞水平上研究FEN - 1基因在DNA 复制和修复过程中的作用提供基础。方法:11hFEN - 1 反义表达质粒的构建 FEN - 1 表达质粒hPET - FCH经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,得到1084bp 的hFEN - 1 片段,经Klenow 补平后两端接上Sal Ⅰ连接头,作为连接反应的外源片段。表达载体采用经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp2 ,以Sal Ⅰ酶切,并用CIP 脱磷酸化,将外源片段和载体片段以T4 连接酶连接过夜,转化感受态DH5α酶切,酶切筛选转化子,得到hFEN - 1 反义表达质粒pMAMneoAmpFNB2。21 细胞转染及筛选 细胞的转染采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法,将MAMneoAmp2FMB2和pMAMneoAmp2质粒分别导入FL 细胞,用含400μg/ ml G418 的MEM 完全培养基筛选,分别得到FL - FEN - 和FL - M 细胞。然后在含200μg/ ml G418 的MEM完全培养基维持培养。31 细胞生长曲线的测定 将FL 、FL - M 和FL - FEN - 细胞按5 ×104/ ml 接种于24 孔培养板,培养基均含有10μmol/ L 地塞米松,另设一组FL - FEN - 细胞不加地塞米松。每组细胞每天各取3 个复孔,用细胞计数板进行计数,共计数8 天。以第2 天和第6 天为对数生长期,计算细胞倍增时间。结果: FL 、FL - M 和FL - FEN - 1 - 的生长曲线没有明显差异,其细胞倍增时间TD 分别为2. 11 天、2. 23 天和2. 23 天。而FL - FEN - 1 在10μmol/ L 地塞米松的诱导下,细胞生长速度明显下降,细胞倍增时间TD 为3. 09 天。进一步分析同时处理的FL - FEN - 1 - 细胞和经地塞米松诱导的FL -FEN - 1 - 细胞,发现经培养第5 天两者出现显著差异( P < 0. 05) ,第6 天以后,表现为极显著差异( P < 0. 01) 。结论: FL -FEN - 1 - 细胞在地塞米松的诱导下生长出现了明显的抑制,细胞倍增时间TD 为对照组的近1. 5 倍。细胞生长曲线的测定发现FL - FEN - (dex. ) 细胞的生长速度在第5 天开始下降,此后持续受到抑制,最后导致部分细胞死亡。这说明在哺乳动物细胞中FEN - 1 基因在细胞繁殖和DNA 复制的过程中起着重要作用,FEN - 1 基因的被阻断导致了细胞生长的抑制。
CROC- 1 基因与细胞增殖控制
陈建明 余应年
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  288-288.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.008
摘要 ( 2882 )   PDF (62KB) ( 2782 )  
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目的:CROC - 1 是人体细胞内新近发现的一个编码泛素缀合酶样蛋白(ubiquitin2conjugating enzyme like protein , Ubc2likeprotein) 基因。已知CROC - 1 基因的酵母同源基因MMS2 参与酵母细胞内RAD6 途径中的无误性复制后修复通路。酵母mms2 无功效突变株表现出REV3 依赖性增变表型(mutator phenotype) 。人CROC - 1 基因是否与酵母MMS2 基因一样,参与人体细胞内的无误性复制后修复、维持基因组的稳定性,至今未见有文献报道。为此,我们运用反义技术建立CROC - 1 基因表达被阻断的FL - CROC - 1 - 细胞系,通过研究该细胞系的一系列生物学特性来分析CROC - 1 基因与DNA 修复、基因组稳定性维持、致癌物诱发的遗传不稳定性及肿瘤发生之间的关系。方法:11CROC - 1 反义RNA 表达质粒的构建:用ACCⅠ酶从pBluescript2Croc21B 上切出840bp 长包含Croc - 1B 蛋白整个开放阅读框的cDNA 片断,用Klenow 片断将其两端填平,再用T4 DNA Ligase 在目的片断的两端连上Sal ⅠLinker ,而后经Sal Ⅰ酶切使其两端皆为Sal Ⅰ粘性末端,再将目的片断用T4 DNA ligase 连到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo2amp2的多克隆位点的Sal Ⅰ切点(经过CIP 处理脱去磷酸基团)上,最后用Nhe Ⅰ酶切(在插入片断上的上游载体的多克隆位点上及插入片断的内部第622 位碱基处分别有一Nhe Ⅰ切点)并分析酶切图谱,从而筛选出反向插入的表达CROC - 1 反义RNA 重组子;21 细胞转染及筛选:用改良的磷酸钙法将构建的CROC - 1 反义RNA 表达重组质粒pMAMneo2antiCROC21 20230μg 转染培养的人羊膜FL 细胞,经G418 筛选培养(400μg/ml) ,3 周后可见细胞克隆,然后换成含G418 的维持培养基(200μg/ ml) 继续扩大培养成FL - CROC - 1 - 细胞系,同时转染空载体pMAMneo2amp2建立FL - MAMneo 细胞系作为载体对照;31 细胞生长曲线测定:将FL 、FL - MAMneo 及FL - CROC -1 - 细胞分别以3 (104cells/ ml) 种于24 孔培养板,每种细胞6 组,每组4 个复孔,经地塞米松(工作浓度为10 - 5mol ,用于诱导重组质粒pMAMneo - antiCROC - 1 表达CROC - 1 反义RNA) 诱导于37 ℃、5 %CO2 下培养24 小时,第二天开始每天计数,计6 天。结果:构建好的重组质粒经Nhe Ⅰ酶切,酶切产物琼脂糖电泳后其一个重组质粒出现228bp 及9kb 二条带,说明该重组质粒是反向插入的表达CROC - 1 反义RNA 的重组质粒pMAMneo2antiCROC - 1 ;pMAMneo2antiCROC - 1、pMAMneo2amp2分别转染FL 细胞,经筛选培养,3 周后分别得到10 多个细胞克隆,换以维持培养基扩大培养成FL2CROC21 、FLMAMneo 细胞系并冻存备用;细胞计数发现,头3 天内FL2CROC212细胞的生长速度与对照FL 及FL2MAMneo 细胞的生长速度无明显差异,从第4 天开始,FL2CROC212细胞的生长速度较对照FL 及FL2MAMneo 细胞的明显要慢,统计分析结果差异明显( P < 0. 05) 。结论:11 本研究成功地建立了CROC - 1 基因表达被阻断的FL - CROC - 1 细胞系;21 本研究结果说明CROC - 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞的生长过程中起正调控作用。
hMMS2 基因表达反义阻断后抑制细胞的生长
陈建明 余应年
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  289-289.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.009
摘要 ( 2165 )   PDF (63KB) ( 2697 )  
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目的:hMMS2 是人体细胞内新近发现的一个编码泛素缀合酶样蛋白(ubiquitin2conjugating emzyme like protein , Ubc2like protein) 基因。已知hMMS2 基因的酵母同源基因MMS2 参与酵母细胞内RAD6 途径中的无误性复制后修复通路。酵母 mms2 无功效突变株表现出REV3 依赖性增变表型(mutator phenotype) 。人hMMS2 基因是否与酵母MMS2 基因一样,参与 人体细胞内的无误性复制后修复、维持基因组的稳定性,至今未见有文献报道。为此,我们运用反义技术建立hMMS2 基因 表达被阻断的FL - hMMS2 - 细胞系,通过研究该细胞系的一系列生物学特性来分析hMMS2 与DNA 修复、基因组稳定性维 持、致癌物诱发的遗传不稳定性及肿瘤发生之间的关系。方法:11hMMS2 反义RNA 表达质粒的构建:用Pst Ⅰ酶从pBlue2 script2hMMS2 上切出837bp 长包含hMMS2 整个开放阅读框的cDNA 片断,用T4 DNA 聚合酶将其两端切平,再用T4 DNA 连接酶在已切平的目的片断两端连上Sal Ⅰ连接子,而后经Sal Ⅰ酶切使其两端皆为Sal Ⅰ粘性末端,再将目的片断两端用 T4 DNA 连接酶连到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo2amp2多克隆位点的Sal Ⅰ切点(经过CIP 处理脱去磷酸基团) 上,最后用Nhe Ⅰ、BstX Ⅰ双酶切(在插入片断的上游载体的多克隆位点有一Nhe Ⅰ切点,而插入片断的内部第296 位碱基处 有一BstX Ⅰ切点) 并分析酶切图谱,从而筛选出反向插入的表达hMMS2 反义RNA 的重组子;21 细胞转染及筛选:用改良的 磷酸钙法将构建的hMMS2 反义RNA 表达重组质粒20 - 30μg 转染培养的人羊膜FL 细胞,在37 ℃ 5 %CO2 条件下用含 G418 (400μg/ ml) 的MEM 全培养液进行筛选培养,每隔2 - 3 天换一次液,同时用空载体pMAMneo2amp2转染FL 细胞,以建 立FL - MAMneo 细胞系作为载体对照; 31 细胞生长曲线测定:将FL 、FL - MAMneo 及FL - hMMS2 - 细胞分别以3 × 104cells/ ml 种于24 孔培养板,每种细胞36 组,每组4 个复孔,经地塞米松(工作浓度为10 - 5mol ,用于诱导转染的重组质粒表 达hMMS2 反义RNA) 诱导于37 ℃5 %CO2 条件下培养24 小时,从第2 天开始每天计数,共计6 天。结果:构建好的重组质 粒经Nhe Ⅰ、Bst Ⅰ双酶切,酶切产物琼脂糖胶电泳后其中一个重组质粒出现553bp 及8. 7kb 二条带,说明该重组质粒就是反 向插入的表达hMMS2 反义RNA 的重组质粒pMAMneo2antihMMS2。pMAM2antihMMS2、pMAMneo2amp2分别转染的FL 细 胞,经G418 筛选培养,3 周后各得到10 多个细胞克隆,而后换以维持性培养液( G418 200μg/ ml) 继续培养并扩大成FL2 hMMS2、FL2MAMneo 细胞系并冻存备用。细包计数结果发现,头3 天内FL2hMMS22细胞尚能缓慢生长,但从第4 天开始 FL2hMMS22细胞其生长基本处于抑制状态,比较对照FL 及FL2MAMneo 细胞的生长速度发现,FL2hMMS22细胞系的生长速 度明显要慢,统计分析结果差异显著( P < 0. 05) 。结论:11 本研究成功地建立了hMMS2 基因表达被阻断的FL - hMMS2 - 细胞系;21 本研究说明hMMS2 基因是细胞生长所必需的基因。
维格尔青春素(DHEA) 毒性及致突变性研究
敬明武 刘以农 郭 明 葛宇杰
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  289-290.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.010
摘要 ( 2420 )   PDF (69KB) ( 2801 )  
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目的:了解DHEA 毒性及短期致突变性情况。本文采用大、小鼠急毒、小鼠骨髓微核、小鼠睾丸染色体畸变试验及Ames试验。现将结果报告如下:方法与结果: ①大、小鼠急性毒性试验:采用霍恩氏法1. 00g/ kg、2. 15g/ kg、4. 64g/ kg、10. 00g/ kg剂量系列,经口染毒,结果测得1 ♀®大小鼠LD50值均大于10. 00g/ kg ,属实际无毒之列。②小鼠骨髓微核试验:采用两次染毒,试验组设0. 5g/ kg、110g/ kg、510g/ kg、10100g/ kg 系列,阴性对照玉米胚芽油,阳性对照CP(40mg/ kg) ,按常规染毒、制片、镜检。结果经统计学分析试验组与阴性组比较无显著性差异( P > 0. 05) 阴性组与阳性组比较有显著性差异( P < 0. 01) 。据此测得DHEA 剂量达10. 0g/ kg 未见诱发小鼠骨髓微核率增高。③小鼠睾丸染色体畸变试验:采用连续5d 染毒法,试验组设1. 0g/ kg、510g/ kg、1010g/ kg 系列,阴、阳性对照分别用玉米胚芽油、CP(40mg/ kg) ,按常规染毒、制片、镜检,结果试验组染色体畸变率与阴性组比较无显著性差异( P > 0. 05) ,而阳性组和各组比较均有显著性差异( P < 0. 01) ,表明DHEA 剂量达10.0g/ kg 未见诱发小鼠睾丸染色体畸变率( %) 增高。④Ames 试验:测试菌株TA97 、TA98 、TA100 、TA102在加与不加S9 混合液条件下,用含该受试物的40μg/ 皿、200μg/ 皿、1000μg/ 皿、5000μg/ 皿剂量系列进行点试、掺入试验,同时设溶剂与阴性对照组,阳性对照用NQNO、2 - AF。结果点试阴性,掺入试验各剂量组与各菌株溶剂对照回变菌落数均接近,表明DHEA 对四株菌无诱变作用。结论:维格尔青春素(DHEA) 属实际无毒,未见有短期致突变性作用。
用家蚕蛹- BmNPV系统建立环境诱变剂致突变检测分析模型的研究
曹 阳  黄自然  葛慈斌  肖巧学  徐光耀  黄亚东  钟仰进  刘良式  王春新  (
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  290-290.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.011
摘要 ( 2498 )   PDF (62KB) ( 2516 )  
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本文新设计提出一个诱变剂致突变检测分析模型,即在家蚕( Bombyx mori) 蛹体内代谢环境中检测环境诱变剂对家蚕核多角体病毒(BmNPV) 的致突变效应和分析与病毒多角体异常有关的三个诱变靶基因的突变分子事件。这一新模型简称“家蚕蛹2BmNPV 系统致突变检测与分析模型”。选用三种诱变剂丝裂霉素C(MMC) 、9 - 氨基吖啶(9 - AA) 、甲基磺酸乙酯( EMS) 与BmNPV 共同接种蚕蛹后,诱变剂对BmNPV 的致突变表型效应分别导致蚕蛹发病时间延迟,蚕蛹发病死亡率的下降具有显著的剂量效应,病蛹血淋巴中发生较高比率的病毒异常形态多角体,并具有继代遗传的稳定性。阴性化学制剂二甲基亚砜(DMSO) 在此测试系统不具有上述的诱变表型效应。继代分离诱变病毒的异常形态多角体,观察到异常多角体的多角体蛋白晶格排列紊乱,蛋白电泳谱与对照有显著不同,诱变病毒感染家蚕Bm2N 细胞的空斑时间延迟,病毒基因组对EcoRⅠ、Bgl Ⅱ、Bam H Ⅰ的某些酶切位点发生变化。采用PCR 扩增诱变病毒的多角体蛋白基因polh 。测序分析结果表明,在polh 基因发生了较高频率的点突变, MMC 诱变组显示G 或C 的碱基替代倾向, DNA 点突变导致的编码氨基酸的位点替代集中分布在polh 读框(ORF) 的上游区域,特别集中于第1 个α- 螺旋区内及其附近。上述结果初步表明,家蚕蛹- BmNPV系统可以用于对环境诱变剂的致突变检测和分析诱变靶基因突变的分子事件,也可为昆虫病毒的诱变遗传学研究提供有效的方法。
双色荧光原位杂交法检测苯系物接触工人精子X,Y 染色体非整倍体率
刘胜勤 郑履康 邓丽霞 唐国慧 张 桥
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  290-290.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.012
摘要 ( 2421 )   PDF (62KB) ( 2729 )  
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为探讨苯系物对男工精子染色体数目畸变的影响,对男工妻子流产率增加提供可能的机理。用X ,Y着丝点染色体特异DNA 探针(分别用生物素和地高辛标记) 同时与人间期精子核杂交,用CY3 - 链亲和素检测X 探针的杂交信号(红色) ,用抗地高辛抗体- 荧光素检测Y探针杂交信号(绿色) 。结果可在同一片子上可以看到有红色杂交信号(X 精子) 与绿色杂交信号( Y精子) 的精子。受试者共13 名车间空气中苯浓度为83. 95mg/ m3 ,甲苯18mg/ m3 ,二甲苯303. 15mg/ m3 。工人尿粘糠酸浓度明显高于对照组( P < 0. 05) 。对13 位苯系物作业工人共计数74517 条精子,X , Y和XY精子双体率分别为0. 15 %、0.13 %和0. 20 %。13 位正常人共计数89662 条精子,X ,Y和XY精子双体率分别为0. 10 ,0110 %和0113 %。接触组与对照组比较,见接触组精子X 双体率(0. 15 %) 及总双体精子率(XX + YY+ XY精子率) (0. 48 %) 高于对照组相应值(分别为0. 10 %和0. 33 %) ,差别有显著性( P < 0. 05) 。结论:高浓度苯(高于国家标准1 倍) 接触可以诱导接触工人精子染色体非整倍体率增加,苯系物男工妻子流产率增加是否与此有关,尚须作更多研究。
MD 型复合净水剂诱变性统计分析
陈学军  王海燕  白 凌
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  291-291.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.013
摘要 ( 2671 )   PDF (61KB) ( 2719 )  
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城市自来水供水卫生问题关系到千家万户的卫生健康。自来水的净化处理是卫生监督管理的一个重要环节,新型MD复合净水剂具有净化效果好,速度快,无环境污染,用量少,生产工艺流程卫生安全经济,投入少特点。特别对地表水处理效果尤佳。为确保广大居民饮用安全卫生无污染自来水,我们依据《辽宁省城镇饮用水卫生监督管理条例》对MD 型复合净水剂进行两阶段管理卫生实验研究。急性经口毒性实验接Horn 氏法进行实验。实验动物健康观察3 日,选用昆明种小白鼠雄雌各半共计40 只。实验前16h 断食不断水。染毒剂量分别为5. 0g/ kg、7. 8g/ kg、13. 8g/ kg、18. 2g/ kg、21. 5g/ kg 体重。经两周实验观察实验动物全部存活。经统计分析查表急性经口毒性实验属实际无毒。大鼠蓄积毒性实验选用Wistar 种大鼠60只雌雄各半,体重180 - 220g。实验采用剂量递增法,经实验观察蓄积系数K> 5. 8 属实际无蓄积性。Ames 实验所采用菌株TA100、TA102、TA98 、TA97 ,菌株基因鉴定性状良好。采用平板掺入法实验。共设三组染毒剂量500μ/ 皿、150μ/ 皿、50μ/ 皿。实验重复两次均为阴性结果。说明该样品对鼠沙门氏菌无直接和间接致突变作用。雄性小鼠精子畸变实验。取健康昆明种小鼠50 只,体重30 - 32g ,随机分成5 组,每组10 只。样品组染毒剂量为1500mg/ kg、2000mg/ kg、3000mg/ kg 体重。阴性对照组给同体积蒸馏水。阳性对照组给环磷酰胺40mg/ kg 体重,染毒28 日,处死实验动物常规镜检,计数精子畸变率,阴性组畸变率13 ‰、实验组畸变率为1118 ‰、1217 ‰、1215 ‰,结果显示本样品经χ2 检测无显著性差异( P > 0. 05) 。经以上两阶段毒理学实验说明本样品是实际无毒LD50 > 5000mg/ kg 体重。K值> 5. 8 属无蓄积性。Ames 实验说明净水剂对鼠伤寒沙门氏菌株无致突变作用。经小鼠精子畸变实验说明净水剂对哺乳动物生殖细胞无诱变作用。本型净水剂是可以安全使用的净水剂。
含铅、无铅汽油尾气排出颗粒有机提取物遗传毒性比较
袁 东 叶舜华
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  291-291.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.014
摘要 ( 3132 )   PDF (61KB) ( 2786 )  
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目的:由于使用含铅汽油,仅1996 年上海汽车尾气中铅排放量达123 吨。我国已于1997 年全面推广使用无铅汽油,无铅汽油的生产不是简单的取代四乙基铅,汽油组分的改变,必然导致尾气的变化,为了评估当前无铅汽油的使用对尾气排放颗粒有机提取物的遗传毒性影响,采用包括以基因突变为测试终点的Ames 试验,以DNA 损伤为测试终点的单细胞凝胶电泳(SCGE) 试验及染色体损伤为测试终点的体外微核试验,对汽油车排出颗粒有机提取物的遗传毒性进行研究。方法:市售的90 # 含铅、无铅汽油在标准试验台架上,在怠速及半负荷工况下,大流量空气采样器收集尾气中颗粒物,并超声震荡提取其中的有机物。鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA98 , TA100 进行Ames 试验,观察菌落回复突变数。单细胞凝胶电泳(SCGE) 正常外周血淋巴细胞经染毒后,细胞裂解、解旋、电泳荧光显微镜下观察拖尾及细胞分级结果。体外微核试验选用CHL 细胞株培养染毒,计算微核率( ‰) 。结果:Ames 试验结果显示两种汽油的颗粒提取物均引起TA98 回复突变菌落数增加,与阴性对照比较均高于2 倍或3 倍,TA98 较TA100 菌株对受试物敏感性高,体外代谢活化系统S9 对受试菌株回复突变数无明显影响。单位重量的无铅汽油颗粒提取物的回复突变菌落数与含铅汽油相比较有统计学意义。单细胞凝胶电泳试验表明两种汽油排出颗粒物随染毒组染毒浓度的增加,每组拖尾细胞数也相应增加,与阴性对照组相比差异有显著性,但含铅、无铅汽油间的比较差异无显著性。CHL 细胞体外微核显示无铅汽油、含铅汽油颗粒有机提取物的微核率均高于阴性对照组( P < 0. 05) ,经多因素方差分析结果显示表明单位重量两种汽油尾气颗粒物的遗传毒性无显著性差异( P > 0. 05) 。以上结果均观察到剂量- 反应关系。结论:遗传毒理学评价是环境化学物安全性评价的一个重要方面,用不同的检测方法有助于得出正确的结论。汽油车尾气排出物是一种成分复杂的混合物,其中含有对人体健康有一定损伤的苯类化合物及多环芳烃类物质。配套三个不同终点的试验结果显示无铅汽油不能有效地降低颗粒物中有机物的遗传毒性,两种汽油燃烧后单位重量颗粒提取物的遗传毒性并没有显著性的差别。我国无铅汽油,仅单纯的取代了四乙基铅对尾气颗粒物排放影响较小,颗粒有机提取物遗传毒性仍然变化不大。
几种理化因素诱导的人白血病HL - 60 细胞HPRT基因突变频率及分子突变谱的研究
刘胜学 曹 佳
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  292-292.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.015
摘要 ( 3114 )   PDF (62KB) ( 2866 )  
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目的:HPRT 基因正向突变试验是国内外广泛采用的致突变检测方法。以往进行HPRT 基因的致突变检测主要有两种方法,即放射自显影法与多核细胞检测法,虽然这两种方法简单、快速,但主要的缺陷是不能进一步确定突变细胞的,这一直是制约HPRT 基因突变研究深入发展的重要因素。方法:本研究选择了具有不同诱变机理的化合物昆明山海棠( THH) 、丙烯酰胺(AA) 、乙基亚硝基脲( ENU) 及物理因子γ2射线,采用镜检、单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重PCR 扩增和双电泳分析等多种技术手段对人急性早幼粒白血病HL260 细胞HPRT 基因的突变发生进行系统研究,以揭示HL - 60 细胞克隆效率与突变频率的变化规律,以及THH 诱导的HPRT 基因分子突变谱与突变机理。结果:11 随着剂量的增加,4 种理化因素均能造成细胞存活率下降,THH、ENU 和AA 等三种化合物的变化趋势均符合数学模型: Y = aebx ,物理因子γ2射线符合模型: Y= a + bx ,并且与正常对照组比较相差非常显著( P < 0. 01) ,即具有细胞毒性,其中AA 细胞毒性较大, THH 细胞毒性较小。同时,4 种理化因素均能诱导细胞突变频率升高,而且有明显的剂量反应关系,表明都具有致突变性,其中THH、ENU 及γ2射线处理细胞的克隆效率与突变频率成负相关,而AA 为正相关。21 自发突变与THH 诱发突变的分子突变谱不一样:自发突变绝大多数是点突变(92. 3 %) ,而诱发突变主要由缺失和点突变两部分组成(分别为46. 6 %和53. 4 %) ;自发突变无全基因缺失,而诱发突变中全基因缺失占12. 1 % ,尤其在高剂量组表现明显。31 比较HPRT 基因突变位点在各个外显子的分布,可见无明显的差异,不存在突变热点;但如果把整个基因等分为三部分,缺失位点的分布就存在明显的区域性,其中基因内缺失位点的53 %(53/ 100) 定位在HPRT 基因3’末端的1/ 3 区域内,这个比例分别是中段、5’末端的119 倍和214 倍。41缺失可以发生于HPRT 基因的每个外显子,但外显子1 、7/ 8 、9 未见单独缺失发生,外显子1 只出现全基因缺失中,外显子7/8 与外显子9 多表现为连锁缺失(71. 4 %) 。结论:通过本研究表明,克隆筛检法结合多重PCR 技术作为一种深入、系统地研究外来化合物致突变性及其分子突变机理的方法,具有广泛的应用前景。
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氯丙嗪、尼莫地平单用和合用对小鼠镉中毒肝、肾毒效应的影响
唐玲芳 陈砚朦 张珍玲 宋 玲 杨永年 冯致英
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  334-337.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.016
摘要 ( 3401 )   PDF (82KB) ( 3036 )  
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摘要 观察钙调素拮抗剂氯丙嗪(CPZ) 和钙离子通道阻断剂尼莫地平(NIMO) 以及同时给予以上两药对镉(Cd) 致小鼠肝、肾毒作用的保护作用。利用模拟镉中毒动物模型。实验组预先灌胃给予小鼠CPZ、NIMO、CPZ + NIMO ,1 小时后以1/ 5LD- 50CdCl2 腹腔注射,连续五天,第六天收集生物样本检测各项指标。结果表明,CPZ 能明显降低血镉,降低尿中r - GT 及NAG活性。CPZ 和NIMO 对于镉引起的钙泵活性降低,均表现出明显的保护作用,两药合用作用增强。CPZ 和NIMO 均能显著提高镉中毒小鼠肝、肾组织中镉金属硫蛋白(MT) 含量。揭示这两种钙拮抗剂对小鼠镉中毒肝、肾毒效应均有防护作用。CPZ 比NIMO 明显。这两种药物合用在某些方面起协同作用。该两药的防护作用可能与MT 参与有关。
钙调素拮抗剂对镉接触小鼠脑突触小体蛋白质合成的影响
唐玲芳 陈砚朦 张珍玲 宋 玲 杨永年 冯致英
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  337-339.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.017
摘要 ( 2695 )   PDF (84KB) ( 2942 )  
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摘要 采用体外高速梯度离心分离提取的小鼠脑突触小体,观察钙调素拮抗剂对镉接触脑突触小体中3H - 亮氨酸掺入蛋白质合成的影响。结果表明镉(Cd) 抑制3H - 亮氨酸掺入突触小体蛋白质合成,3H - 亮氨酸掺入量与镉浓度呈负相关。这一作用可被钙调素拮抗剂氯丙嗪一定程度上拮抗。提示钙调素参与镉的毒性作用机制。
蔷薇红景天对两种肿瘤生长的抑制作用及其免疫学机制
赵 文 蒋东升 王庭欣 马哓彤 秦淑贞 张俊刚 边庆荣
癌变·畸变·突变. 1999, 11(6):  339-342.  doi:10.3969/j.issn.1004-616x.1999.06.018
摘要 ( 1739 )   PDF (78KB) ( 2643 )  
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摘要 采用动物移植性肿瘤实验法观察了蔷薇红景天提取液对S - 180 实体型和H - 22 生长的抑制作用,并试探讨了红景天提取液抑瘤作用的免疫学机制。结果表明,红景天提取液在1250~5000mg/ kg. bw 剂量范围内,能明显地抑制S - 180 在小鼠体内的生长,抑瘤率高达63. 71 %;在剂量为1250mg/ kg. bw 时,能一定程度地抑制H - 22 的生长,但效果可疑,还需进一步重复试验。红景天提取液在500~2000mg/ kg. bw 剂量范围内,能一定程度地增强荷瘤小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。