材料与方法 取健康成年小白鼠一只取血, 稀释。设1 个阴性对照组和4 个N aF 受试物组, 剂量分别为1 Lmo löL 、2 Lmo löL 、4 Lmo löL 、8Lmo löL 。37℃染毒小时, 制备细胞混悬液。用1% 正常熔点琼脂糖(NMA ) 打底, 0. 5%NMA 100 Ll 铺第一层, 取已处理细胞混悬液10Ll 与75 Ll 0. 7%低熔点琼脂糖(LMA ) 混匀, 铺第二层, 0. 7%LMA 85 Ll 铺第三层; 然后将铺好的玻片置4℃消化液中消化2 h, 4℃电泳缓冲液中碱解15 m in, 电泳20 m in (25 v, 300 mA )。以中性洗液冲洗玻片, EB 染色。用OL YM PU S 荧光显微镜观察。每个样本随机选择100 个细胞, 尽快用目镜测微尺测定DNA 直径(a) 和DNA 迁移长度(b) , 并以a、b 比值[böa < 1ö2 (+ ) , böa> 1ö2 (6 ) ,böa > 1 (7 ) ]为标准分类, 记录并拍照。 结果与讨论 DNA 图象呈橙黄色, 与阴性对照组比较,N aF 各剂量组均可观察到不同程度的拖尾现象, 即有受损细胞出现; 且随着N aF 剂量的增加, 受损细胞阳性率呈上升趋势, 存在明显的剂量2反应关系, 相关系数r= 0. 9895 (0. 001< P < 0. 01) , 受损细胞阳性率(Y) 与剂量(X) 之间的回归方程为: Y= 0.028+ 0.056X (0. 001< P < 0. 01)。DNA 粒径(即DNA ) 迁移长度在各剂量组和对照组之间均有显著性差别, 且DNA 迁移长度和N aF 浓度之间也有剂量2反应关系, 相关关系为r= 0. 98 (0. 001< P < 0. 01) , 经回归分析得DNA粒径与N aF 剂量的回归方程为: Y= 14. 9785+ 0. 3525X (0. 001< P < 0. 01)。应用公式: 彗星指数= 1öN (n1+ 2n2+ 3n3) (n1, n2, n3分别为受损程度为+ 、6 、7 的细胞数,N 为每张片子观察细胞总数) , 计算各组的彗星指数, 可见随N aF 浓度增加, 该指数增大, 表明DNA 的受损程度加重。因而本实验从另一方面证明N aF 对DNA 具有损伤作用, 并且存在剂量2反应关系, 显示氟具有诱变性,可引起染色体断裂, 导致染色体畸变; 也提示氟可能具有潜在致癌性

为了提高K噬菌体体外重包装致突变检测系统的特异性和利用该系统用于致突变分子机制的研究, 我们引入了LacZ 基因作为靶基因和报告基因。乙基亚硝基脲(1-ethyl-12nitrosourea, ENU ) 和9-氨基吖啶(92aminoacriaine, 9-AA ) 直接处理含L acZ 基因的KgtllDNA , 在体外重新包装为噬菌体, 然后转染宿主菌Y1090 并在含X2Gal 和IPTG 的选择培养基上培养。通过计数清亮斑突变体和兰斑野生型的数目计算噬菌体的存活率和突变率; 扩增和测定突变噬菌体中L acZ 基因的序列, 分析了两种化合物的分子致突变机制。结果表明: 在ENU 和92AA 作用下, 噬菌体存活率明显下降, 而突变率则相应上升, 并呈较好剂量2反应关系; 9-AA 主要诱发移码突变(71. 8%) ,A , G, C, T 4 种碱基发生移码突变率分别为27. 3% , 24. 2% , 24. 2%和24. 2%; 92AA 诱发的单个碱基缺失主要发生在相同的碱基的重复区内(68. 6%) , 在单个或2 个重复碱基位点发生缺失频率较底。2AA 诱发碱基置换主要是碱基巅换(92% ) , G: C 碱基对比A: T 碱基对易于诱发碱基置换(76. 7% vs 24. %) ; 9-AA 诱发碱基置换后一般易于同邻近碱基形成相同碱基的重复。ENU 诱发的突变主要发生在G: C 碱基对上; ENU 诱发碱基置换主要是G: C→A: T、G: C→C: G 和A: T →T: A 巅换。该实验表明含有L acZ 靶基因的Kgt llDNA 致突变检测系统比KDNA 致突变检测系统更完善。该系统以噬菌斑的存活率、突变率和分子突变谱作为检测终点, 不仅提高了检测系统的特异性和敏感度, 而且能进一步研究化合物的致突变分子机制和进行危险度的评价。

在研究辐射生物效应中, 检测DNA 损伤的方法很多。例如: 细胞遗传学方法染色体畸变、微核、姐妹染色单体互换等等。但上述方法费时费力, 并有一定的局限性。八十年代由O st ing 等首次提出的用微板电泳技术检测单细胞水平DNA 损伤。后经Singh 等进一步改进和完善了单细胞微凝胶电泳Single Cellm icrogel elect ropho resis 简称SCGE) 技术, 又称彗星检测法(Comet assay)。该方法突破了传统局限性, 即设备、操作简便, 所需细胞少、无需放射性示踪剂, 而且灵敏、快速, 整个实验过程从来样到结果分析可在一个工作日完成的新技术。因此, 该技术在国外有关研究领域已得到广泛应用。近年来, 国内一些研究领域也引进和建立此方法。主要用于环境诱突变剂或诱癌剂引起的DNA 损伤ö修复的研究; 癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学预后的研究; 作为生物标记进行生物监测及流行病学、毒理遗传学等诸多领域的研究。目前, 也有一些专家学者将此技术应用于植物细胞的研究。SCGE 技术在本实验室已建立, 其方法是使包埋于琼脂糖中的细胞经裂解去掉细胞浆, 在碱性环境下DNA 双链螺旋成为单链, 在电泳电场作用下DNA 断链离开细胞核向正极迁移出现“彗星”状拖尾现象, 再通过荧光染料溴化乙啶结合DNA 显色检测其损伤程度。为将此技术推广于辐射生物效应体内外研究中, 本实验选用在辐射生物效应中经常用的人血淋巴细胞(HBL ) , 中国仓鼠肺细胞(CHL ) 和兔血淋巴细胞这3 种细胞探索利用此技术检测DNA 损伤的可行性。实验结果表明: SCGE 技术能够对单个细胞DNA 损伤进行研究, 荧光测定核DNA 直径和迁移DNA (即彗星尾) 长度, 而尾长度和尾部荧光强度与DNA 链的断裂呈正相关。由于“彗星”成像是因损伤DNA 在电泳中从核内迁出, 因此它的尾长和密度等是评价与量化电泳结果的重要因素。我们选用上述3 种细胞接受60Co2·线照射后, 经SCGE 技术检测DNA 损伤, 照射组与未照射组DNA 迁移距离经统计学检验, 差异显著性水平A= 0. 5。细胞经照射处理后可引起DNA 电泳迁移, 而迁移长度随照射剂量的增加而延长。此项技术可从受照人员外周血淋巴细胞DNA 电泳迁移长度来估算受照剂量, 从而为评价急性照射和慢性小剂量长期照射的损伤程度提供科学依据。

烷基酚类化合物, 被广泛地用作塑料增塑剂、工业用洗涤剂、农药乳化剂、纺织行业的整理剂等。不但污染广泛, 而且已经发现该类化合物亦可促乳房癌细胞活性化与增殖, 属环境内分泌干扰物。为了探讨烷基酚类化合物的诱变活性, 本文应用单细胞凝胶电泳技术研究了9 种烷基酚类化合物对原代小鼠睾丸细胞DNA 的损伤作用。实验结果表明,DM SO 阴性对照组仅有5% 的细胞出现DNA 迁移, 且迁移距离很小, 损伤程度为5 (专用单位) ; 而MMC 的阳性对照组表现出99. 5%的细胞拖尾率, 并且细胞严重损伤, 其损伤程度为248. 00 (专用单位) , 这证明了本实验系统的可靠性。实验结果还表明, 9 种烷基酚类化合物对小鼠睾丸细胞均能引起不同程度的DNA 损伤, 并呈现明显的剂量效应关系, 其高剂量组与对照组相比, 均有极显著性差异(P < 0. 01) , 揭示烷基酚类化合物对DNA 有明显的损伤作用。各浓度在染毒1. 5 h 后, 所有细胞存活率均大于90% , 说明DNA 损伤系受试物遗传毒性所致而非细胞毒性。本实验按毒性试验结果, 将9 种化合物分为两类不同剂量组型(A 组型及B 组型) , 在A 组型(1 mgöL 、5 mgöL , 20mgöL ) 中, 拖尾率最高的是色醇, 依次是42乙基酚、邻甲酚、苯酚; 在B 组型(0. 25 mgöL 、0. 5 mgöL、1 mgöL ) 中, 拖尾率最高的是五氯酚, 依次是42辛基酚、42壬基酚、2, 3, 42三氯酚、2, 42二氯酚。实验结果亦表明,DNA 的损伤程度与化学结构有一定的关系, 苯酚环中增加其他基团, 可使致突变活性增强, 并且随着苯酚环中氯原子数的增加, 致突变活性也增强; 随着苯酚对位碳原子数增多, 其致突变活性也增高等。研究化学物对生殖细胞的遗传损伤, 可揭示其对后代潜在的遗传学危害, 故检测生殖细胞DNA 的损伤, 对于研究生殖功能的障碍具有重要意义。

TK 基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外短期致突变实验, 它具有很高的灵敏度, 可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。TK 基因突变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L 5178Y 以及人类淋巴母细胞TK6 和W TK1 等, 其基因型均为tk+ ö-.。使用L 5178Y 细胞的试验(即小鼠淋巴瘤细胞试验) 发展较早, 已形成一套比较完善的方法。而TK6 和W TK1 等人类来源的细胞在TK 基因突变分析中的应用时间还不长, 其方法尚不太成熟且资料有限, 但因为来源于人类, 在评价受试物对人体的损伤方面意义可能更大。有关小鼠淋巴瘤细胞和人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的灵敏度与特异性方面的比较性研究的报告尚不多见。本研究使用3 种常规诱变剂(MM S、EM S、MMC) 和一种非诱变剂(KCl) , 分别采用琼脂平皿法和微孔平板法对两种细胞(L 5178Y 与TK6) 的灵敏度和特异性进行比较研究。研究结果表明,直接比较同一受试物诱发两种细胞的突变频率, TK6 细胞显著低于L 5178Y 细胞。比较两种细胞的相对突变指数时, TK6 细胞突变指数显著高于L 5178Y 细胞。而且TK6 细胞在较低浓度的受试物剂量下即可诱发突变频率、突变指数的显著增加。说明TK6 细胞在本试验中比L 5178Y 细胞敏感。两种细胞采用两种方法对4 种受试物的致突变性评价结果一致, 即3 种强致突变剂的检测结果均为阳性; 微孔法检测KCl 的结果两种细胞均为阳性, 而琼脂法的检测结果均为无反应。结论: 使用TK6 细胞和L 5l78Y 细胞对4 种受试物的检测结果基本一致, 但TK6 细胞在检测低毒性、低浓度受试物时优于L 5178Y 细胞。另外, 从对人类的实际意义来看, 也应推广TK6 细胞在TK 基因突变分析中的应用。

放疗是治疗肿瘤的主要方法之一, 特别是鼻咽癌病人多以放射治疗为主。放疗在破坏肿瘤细胞的同时, 对正常细胞也会产生遗传损伤。由于放疗可诱发细胞DNA 损伤、HPRT 基因突变、染色体畸变等, 因此, 本文采用彗星电泳实验和多核细胞法检测鼻咽癌患者外周血淋巴细胞DNA 的损伤及HPRT 基因突变率。检测对象为10 例接受X2射线放疗的鼻咽癌患者, 均来自第三军医大学 附属西南医院放疗中心, 患者平均年龄37 岁(28～ 55 岁) , 男女各5 例, 照射总剂量平均为68 Gy。本次实验以病人为自身对照, 分别于放疗前、照射2、5、14、24、34 次后各采血一次用于实验(每次照射剂量为2 Gy)。彗星电泳实验: 用2 倍体积的淋巴细胞分离液分离细胞, 制成1×105 个细胞öm l 的细胞悬液(细胞存活率> 95%) , 按常规制备双层琼脂铺片, 经裂解、伸展、电泳后用溴化乙锭染色, 荧光显微镜下观察细胞的拖尾率及DNA 的迁移度。HPRT 基因突变率检测采用淋巴细胞全血培养法, 在加与不加62巯基嘌呤的条件下培养至72 h, 收获细胞。每例计数2 000 个转化的淋巴细胞(加6-TG 和不加6-TG 的各1 000 个细胞) , 记录同一胞质内具有完整核膜的相压、相切或分离的双核或多核的淋巴细胞数, 计算其细胞HPRT 基因突变率。结果: 彗星实验结果表明放疗对病人淋巴细胞DNA 有明显的损伤作用, 并有良好的剂量2反应关系。HPRT 基因突变率与放疗前相比有显著升高, 并在照射剂量累积到28 Gy 时达到一个高峰, 以后稳定在一个高水平平台上。结论: 一定剂量的X2射线放疗对鼻咽癌患者外周血淋巴细胞DNA 有明显的损伤作用, 并可诱发淋巴细胞HPRT 基因突变。放疗对鼻咽癌患者导致的遗传损伤应引起重视, 同时有必要进一步探讨DNA 损伤和HPRT 基因突变作为放疗生物剂量仪的可能性。

微核试验作为细胞遗传学损伤的生物标志之一, 是公认的检测染色体异常的简便方法, 在医学领域中正得到越来越广泛的应用。X2射线放疗是鼻咽癌患者最主要的治疗方法。本文采用微核试验方法观察鼻咽癌放疗患者口腔颊粘膜脱落细胞及人外周血淋巴细胞微核率的变化, 以探讨微核作为正常细胞损害和受照剂量生物标志物的可能性。检测对象为10 例接受X2射线放疗的鼻咽癌患者, 均来自第三军医大学附属西南医院放疗中心, 患者平均年龄37 岁, 男女各5 例, 照射总剂量平均为68 GY。本次实验采用病人为自身对照。分别于放疗前, 照射2、5、14、24、34 次后(每次限射剂量为2 GY) , 各采血一次用于实验。口腔颊粘膜脱落细胞微核试验: 取口腔颊粘膜脱落细胞直接涂片, 固定后用吖啶橙染色, 荧光显微镜下观察1 000 个脱落细胞中的微核细胞数。人外周血淋巴细胞微核试验采用胞质分裂阻滞法微核试验, 取0. 5 m l 静脉血于4. 5 m l RPM I 1640 培养基中37℃培养44 h 加入6 mg·L - 1的松胞素B, 继续培养至72 h 收获细胞, 常规制片。微核判断标准: 在淋巴细胞胞质中, 与主核分开, 呈圆形或椭圆形, 边缘光滑, 折光性与主核一致或稍浅, 大小为主核的1ö3～ 1ö的小核。每例记数1 000 个细胞, 结果用千分率表示。结果: 口腔颊粘膜脱落细胞微核率放疗前后未观察到明显变化。外周血淋巴细胞第一次放疗后微核率即有显著升高, 以后随剂量的增加几乎成线性升高。结论: 一定剂量的X2射线照射后, 对鼻咽癌患者口腔颊粘膜无明显损伤作用, 而外周血淋巴细胞微核检出率则非常敏感, 并呈正相关的剂量-反应关系, 有可能作为受照剂量的一个备选生物标志物。

本文作者1999 年对107 例长期从事放射工作的人员进行了医学普查, 以了解从事放射工作的人员随着放射工龄和累积剂量的增加, 人体的一般健康状况、外周血液指标及淋巴细胞染色体的畸变率的变化等, 尤其是人类染色体畸变情况, 因为它严重影响人体的正常生理状态, 并且殃及后代。因此, 研究从事放射工作人员的染色体, 对保证职业者的身体健康、进行放射防护具有重要意义。我们对本地区107 例从事放射工作的人员进行染色体及微核检查, 被测人员中男性99 人, 女性8 人, 年龄在21～ 57 岁之间, 从事放射工作最短为1 年, 最长为38 年。检查结果: 107 人中有8 人的染色体出现不同程度的畸变, 其余99 人正常, 微核检查结果均在正常范围之内。从遗传角度而言, 染色体是遗传物质, 一般情况下是比较稳定的, 虽然环境因素会造成一些染色体的变异, 尤其是在射线的影响下, 会造成染色体的断裂, 使染色体发生畸变。有资料记载, 小剂量照射可诱导广泛的适应性反应, 并可抑制肿瘤实验转移, 但随着照射年龄的增加, 机体不断地衰老, 适应和修复能力减弱, 损伤与修复能力就会失衡, 染色体畸变率就会显著增高。总之,通过对这些从事放射性工作人员的染色体研究, 进一步证实辐射可造成染色体畸变, 但由于机体的修复作用可对这些畸变进行修复, 因此, 建议从事放射工作的人员要进行定期检查和定期休养, 并改进防护措施, 以保证职业者的身体健康。

目的: 检测PDP 紫杉醇是否对小鼠骨髓细胞产生致突变作用, 为临床安全用药提供依据。方法: 用小鼠骨髓细胞染色体畸变试验及小鼠骨髓细胞微核试验对PDP 紫杉醇进行了致突变性研究。各试验分别取昆明种小鼠30 只, 雄性, 体重18～ 20 g, 随机分为5组, 每组6 只, PDP 紫杉醇设高、中、低3 个剂量组, 给药剂量分别为120 mgökg (1ö2 LD50)、60 mgök g、30 mgökg, 给药途径为iv, 并设阳性对照组( IP 给予CP 60mgökg) 及阴性对照组( iv 给予无菌生理盐水20m lökg)。CP 组采用一次给药后24 h 取材, 其余4 组根据预试结果采用一次给药后48 h 取材。小鼠颈椎脱臼法处死后取出双侧股骨, 按常规法制片, 镜检嗜多染红细胞微核率、骨髓细胞染色体畸变率。结果: PDP 紫杉醇高、中、低3 个剂量的小鼠嗜多染红细胞微核率分别为12. 50‰±1. 87‰、7. 33‰±1. 63‰、2. 71‰±0. 75‰, 阳性对照组为50. 33‰±7. 92‰, 与阴性对照组(1. 67‰±1. 17‰) 比较, 高、中、两个剂量组及阳性对照组均有非常显著性差异(P < 0. 01)。PDP 紫杉醇高、中、低3 个剂量的骨髓细胞染色体畸变率分别为23. 6%、16. 6%、3. 6% , 阳性对照组为50. 4% ,与阴性对照组(1. 6%) 比较, 高、中、两个剂量组及阳性对照组均有非常显著性差异(P < 0. 01)。结论: 在本实验室条件下, PDP 紫杉醇对昆明种小鼠骨髓细胞的微核试验、骨髓细胞染色体畸变试验均为阳性。说明PDP 紫杉醇具有致突变性。

目的: 国家环境保护总局计划2000 年在全国普遍推广使用无铅汽油。无铅汽油的主要添加剂—甲基叔丁基醚(Methyl Tertiary Butyl Ether,M TBE) 从七十年代开始使用, 因其能提高汽油的辛烷值, 增加汽油的含氧量而普遍受到欢迎。但直到八十年代末期, 国外学者才开始对它的毒性和健康危害进行较为系统的研究, 毒理学结论尚不确定。本文初步探讨了国产M TBE 的遗传毒性。方法: 体外试验采用Ames 试验, 菌株采用鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型突变菌株TA 98 和TA 100, 用大鼠肝微粒体酶系(S9) 模拟MTBE 代谢前后物质, 采用标准平皿掺入法, 用DM SO 作阴性对照, 阳性对照非活化者(不加S9) , TA 98 加2, 72二氨基芴(2. 72A.F) , TA 100 加叠氮化钠(SA )。活化者(加S9) 均加入22氨基芴(22A. F)。M TBE 染毒剂量分别为每皿25, 50, 100 Lg, 37℃培养48 h后, 用自动菌落计数仪计数。观察不同染毒剂量组间及与阴性、阳性对照间的菌落数统计学差异。采用单细胞凝胶电泳法检测了国产M TBE 大鼠经口亚慢性染毒后血液有核细胞的DNA 的损伤状况, 大鼠染毒剂量分别为1 000, 600, 200 (mg·kg21) , 时间为每天一次, 每周5 d, 共13 周。各组动物末次染毒后眼球采血, 抗凝, 制成大鼠细胞悬液备用。用无钙镁PBS 配置低熔点琼脂糖(LM PA ) 和正常熔点琼脂糖(NM PA ) , 在磨砂的载玻片上制作中间包埋大鼠血细胞的“三明治”, 经裂解、解旋、电泳、漂洗等步骤、溴化乙锭染色, 荧光显微镜下观察。根据细胞有无拖尾现象及彗星尾部面积占头部面积的百分比(% ) , 将细胞分成5 级(0～ IV ) , 标准为: 0 级, < 5%; É 级, < 20%; Ê 级, 20%～ 39%; Ë 级, 40%～ 94%; Ì 级, 95%～ 100% , 计算出拖尾细胞百分率及各级的细胞数结果: 结果表明在Ames 试验(TA 98 和TA 100 菌株) 中, 在加与不加S9 的情况下,M TBE 均未表现出明显的致突变性。染毒大鼠血液有核细胞DNA 的断裂损伤与对照组比较也未见统计学差异。结论: 本研究结果未发现M TBE 对受试系统有致突变性。